第一节　临床前研究

一、超声造影剂的研究

国内左心超声造影研究是近30年前由南方医院心血管内科开始的。1989年在谢峰教授一文的启发下，南方医院刘伊丽教授带领她的研究生开始了超声造影的研究。一切从零起步，经历了造影剂开发、心脏超声造影方法学、心肌缺血的系列动物实验、分子成像、临床和临床基础等研究阶段，度过了漫长而艰难的岁月。

罗支农最早应用上海CPS-IA超声粉碎仪，25W功率对复方泛影葡胺声学处理60s，使液体呈毛玻璃状，制作成空气微泡供即刻注射，同时应用HP Sones-1000超声仪，经主动脉行MCE，并与公司合作研制了心脏图像分析系统。

唐志宏进一步应用自制的空气微泡经主动脉注射，估测犬冠脉血流储备，以美国Interspec Apogee CX-200超声仪和加拿大Matrox PIP-1024B图像处理板作心肌显像和图像分析。结果表明，此造影剂半衰期短，经静脉注射不能评价心内膜下心肌灌注。

在此基础上，查道刚和谢晋国等对比了5%白蛋白低分子右旋糖酐、1%白蛋白低分子右旋糖酐、1%白蛋白生理盐水和5%白蛋白生理盐水等溶液的声振结果，应用美国XL2020型声振仪、血细胞计数器、光学显微镜，C6型网型目镜尺和电视显微测微仪测定微泡浓度和大小，观察造影剂对SD大鼠微循环的影响。结果证明，用XL2020仪9档×60s处理5%白蛋白生理盐水得到的造影剂安全有效。他们进一步探讨左心声学造影剂最佳制备条件，用不同浓度人血白蛋白与不同浓度葡萄糖溶液进行声振，证明XL-2002声振仪，9挡声振处理60s 2%白蛋白10%葡萄糖溶液制备的声学造影剂微泡浓度高、直径合适且安全有效，理化特性与Albunex相当。

实验室研究成功后，与南方医院药学系陈志良主任合作进入产品开发阶段。药学系投资建立了洁净生产车间，同时购置了Culter-Counter系统，准确测定微球直径、分布和浓度。1999年，第一代造影剂，5%白蛋白空气微泡造影剂“东冠”获国家二类新药证书，并进行了技术转让。在此基础上开始第二代造影剂的开发，制作白蛋白氟碳微泡。陈树元药师进一步改进工艺，建立冻干技术，获国家发明专利和广东省优秀发明专利，并通过临床前研究、临床Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期研究，于2006年获国家生物制剂一类新药证书，进入药品上市阶段。

二、超声造影的方法学研究

查道刚最初应用经主动脉导管弹丸注射造影剂，同时进行心脏连续录像，应用本校研制的心脏图像分析系统和心肌灰阶分析软件进行脱机分析绘出造影时间-强度图。1999年查道刚教授应用Sequoia 512超声系统在国内首先实现经静脉MCE，利用MCE强度与触发间隔时间的关系定量心肌血流速度和毛细血管密度，实现MCE的触发成像，同时自制触发辅助仪实现长触发间隔。

进一步通过持续静脉滴注法定量心肌血流，在Sequoia 512实现实时成像技术、微泡破坏（micro bubble destruction，MBD）技术、相干对比成像技术（coherent cardiac imaging，CCI）、声学造影图像定量分析和MCE的彩色编码基础上探讨了超声造影剂注射方法和超声造影剂的输注速度。

20世纪90年代谢峰和他的团队在中国人民解放军总医院（301医院）和中国医学科学院阜外医院最早引用氟碳造影剂和二次谐波进行了一些研究，发表了系列论文，对指导和推动国内的超声造影发展起到重要的作用。

在上述研究的基础上，左室声学造影、心肌声学造影、心脏外超声造影取得了系列成果。详见本书各相关章节。

三、系列动物实验——从微血管水平探讨不同类型的心肌缺血

1.顿抑心肌

在开胸犬的动物模型上，罗义首先成功建立了心肌顿抑模型，证明了缺血再灌注后心肌灌注恢复和心功能恢复滞后的现象。

2.冬眠心肌

南方医院宾建平建立了慢性多支冠脉狭窄的犬模型，探讨可逆性左室功能低下（冬眠心肌）时的病理生理现象，证明MCE在药物负荷下检出的冠脉储备能力缺陷可用于冠脉狭窄的诊断。

3.缺血预适应及存活心肌

张稳柱、谢志泉等观察到MCE可对犬急性心肌梗死进行诊断，当心外冠脉某主支发生急性闭塞时，含微泡的血不能进入该冠脉灌注领域的微循环，显示为局部心肌灌注缺损（危险区心肌）。在此模型上MCE还成功观察到冠脉侧支循环。如果在梗死前先经历数次心肌缺血，则梗死心肌的范围将明显缩小（缺血预适应），证明通过延长触发间隔的方法可评估是否有存活心肌。

4.心肌缺血再灌注损伤

冯金华等还成功建立了心肌缺血再灌注后的心肌无复流的犬模型，同时证明无血流再流区的心肌无代谢，属梗死心肌，MCE判定结果与病理的检查结果一致。

四、微泡空化的损伤性研究

微泡发生惯性空化破裂时可以释放出很大的能量，对附近细胞或组织产生空化效应，造成细胞或组织的损伤，此损伤可用于基因转染。南方医院修建成等观察到白蛋白微泡在诊断和治疗剂量超声作用下对大鼠脊斜肌微血管的损伤情况，结果表明：诊断剂量超声，对大鼠脊斜肌经皮或直接发射超声，活体显微镜下未发现脊斜肌上有出血点，切片光镜观察未发现微血管和组织损伤；而治疗剂量超声照射后，活体显微镜下可见脊斜肌出现小出血点，切片光镜观察发现红细胞外溢，电镜可见外溢孔通道，实质是血管内皮细胞的撕裂所致。这种外溢的通道具有可修复性。超声能量越大、照射时间越长、微泡输入速度越快时，微泡空化在大鼠脊斜肌微血管造成的出血点越多，损伤越重。黄武峰、修建成等还发现了微泡空化效应对大鼠骨骼肌局部微循环产生损伤跟超声的能量有关，且能量越小产生的损伤越轻，局部微循环的损伤修复速度越快。

五、应用减阻剂改善微循环的研究

在不改变驱动压的情况下，向流体中加入极少量（纳摩尔级）的某些高分子聚合物后，流体的黏滞度和密度无明显改变，但流体阻力明显降低，流速增加。这种现象称为Tom’s效应，而这些高分子聚合物常被称为“减阻剂”（drag reducing polymers，DRP）。临床实践认识到，在重视心外冠脉血运重建的同步，针对冠脉循环的第二部分，即心肌微血管床的征募治疗，是治疗冠心病的新思路。2000年以来，国外将减阻剂用于生命科学，证明减阻剂可延长失血性休克大鼠的存活时间，可改善休克动物的氧供，可改善急性冠脉狭窄犬的心肌血流灌注，同时可提高急性心肌梗死大鼠的存活率。南方医院心内科刘伊丽团队从2010年以后开展了减阻剂的实验研究：陈向辉等首先自制成聚氧化乙烯[poly（ethylene oxide），PEO]减阻剂，证明5×106Da的PEO具有良好的减阻效能，能减低湍流环境中的摩擦系数。陈向辉和崔凯建立鼠脊斜脊微循环的实验模型，证明减阻剂能显著增加微动脉和微静脉的血流速度和血流量，并增加微动脉血管壁的切应力。陈向辉等还建立了大鼠急性心肌梗死模型，通过MCE证明减阻剂可减少梗死面积并改善左心功能。此外，胡峰、査道刚等还建立了大鼠急性后肢缺血模型。证明减阻剂可显著改善缺血肢体骨骼肌微循环的血流量和血流速度。以上研究表明，减阻剂改善微血管功能值得进一步深入探讨。

六、超声造影用于溶栓的基础和临床研究

已有的研究表明，超声波结合微泡可引起溶栓的效果。其机制为在超声场中微泡的空化效应所产生的震动使纤维蛋白的结构松解，使溶栓剂更容易渗透入血栓中。陈向辉观察了应用长脉冲超声（US）条件下，脂质体微泡造影剂协同重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）的溶栓效果。结果表明，rt-PA+高占空比US组的溶栓效果高于单纯rt-PA组和rt-PA+低占空比US组。宾建平等成功制作了富含血小板血栓和富含红细胞血栓和大鼠急性脑栓塞的卒中模型，探讨超声与微泡联合促溶技术在消除脑微循环微血栓及再灌注损伤保护中的作用。结果表明，微泡介导的声学溶栓改善了微血栓引起的急性缺血性卒中的梗死容积和神经积分。2015年吴爵非等应用对犬急性心肌梗死模型，观察改良的诊断US和微泡对梗死面积的影响。结果提示梗死区心肌室壁增厚（wall thickening，WT）率为9%，全量rt-PA后WT为8%，心电图上抬高的ST段未回落；半量rt-PA加微泡后，WT由11%增加到19%，且升高的ST段回落，说明微血管血流灌注恢复。目前，宾建平正在主持一项临床试验名为声学溶栓改善急性心肌梗死患者心肌微循环灌注及预后的多中心临床研究，详情请参见本书第十八章第三节的第二部分超声联合造影剂微泡应用于急性冠脉综合征。

七、靶向超声分子成像和药物基因输送的研究

特异性靶向微泡是指超声微泡表面携带有大分子特异性抗体、配体或基因片段。特异性靶向微泡进入身体后与病变组织的特异抗原、受体或基因靶向结合，超声成像显示病变处微泡聚集，从而形成分子诊断。重庆医科大学王志刚教授及其团队在新型多聚体微泡超声造影及靶向造影剂的分子成像研究方面做出了杰出的贡献，发表了一系列高质量的科研论文。南方医科大学宾建平及其研究队伍近年也在靶向超声分子成像和药物基因输送方面做了大量研究工作。宾建平等证明，通过对细胞间黏附分子-1的靶向分子成像可将前期发作的急性心肌缺血在后期记忆性的被发掘出来；通过血小板GPⅡb/Ⅲa分子成像可检出不稳定的动脉粥样硬化斑块；同理，环精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）修饰的微泡靶向GPⅡb/Ⅲa受体可在体诊断炎性血栓。宾建平等还证明通过低氧诱导因子-1α的突变形式可靶向诊断新生血管。吴爵非还创建了磁性微泡，通过磁性微泡靶向VCAM-1可进行动脉粥样硬化的分子诊断。在药物基因靶向传输方面，宾建平等报道了叶酸耦联纳米微泡，通过超声触发细胞内爆发靶向杀伤肿瘤细胞；吴爵非、宾建平等报道硫化氢靶向微泡减少心肌缺血再灌注损伤。此外，宾建平等还证明，P-选择素超声分子成像可评估房颤的血栓风险；适当声压的微泡破坏可选择性减少肿瘤的新生血管。总之，超声微泡靶向分子在诊断和治疗上的实验研究已在国内较深入地进行。