第二节　革兰氏阴性菌的耐药机制

细菌对抗菌药物的耐药性可分为天然耐药和获得性耐药，前者是指某一种属的细菌由于其结构和生理的特殊性而对某种抗菌药物的固有耐药，如嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类药物天然耐药；而获得性耐药则是由于细菌发生基因突变或获得外源性耐药基因。细菌可以通过产生灭活酶或钝化酶、改变抗菌药物的作用靶位、降低外膜通透性、主动外排系统高表达等多种机制获得耐药性。

一、药物灭活酶或钝化酶的产生

细菌可产生多种灭活酶或钝化酶作用于抗菌药物，使药物失去抗菌活性。革兰氏阴性菌常见的灭活酶或钝化酶包括β- 内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、四环素类灭活酶、磷霉素灭活酶、氯霉素乙酰转移酶等。

（一）β- 内酰胺酶

革兰氏阴性菌对β- 内酰胺类药物最主要的耐药机制是产生多种β- 内酰胺酶，它可与药物分子结构中的β- 内酰胺环结合并使之打开，从而使抗菌药物失活。目前已发现1 000多种β- 内酰胺酶，主要采用Ambler和Bush-Jacoby两种方法分类。Ambler分类是根据β- 内酰胺酶的结构将β- 内酰胺酶分为A、B、C、D四类。其中A、C、D类酶的活性部位需要丝氨酸，为丝氨酸酶；B类酶需要二价金属离子（Zn2+）存在才能发挥活性，故又称为金属酶。Bush-Jacoby分类则根据β- 内酰胺酶的功能将其分为1群头孢菌素酶、2群青霉素酶、3群金属酶（碳青霉烯酶）和4群不确定酶。临床最重要的β- 内酰胺酶是超广谱β- 内酰胺酶（ESBL）、AmpC酶和碳青霉烯酶。临床革兰氏阴性菌产生的主要β- 内酰胺酶见表1-1所示。

ESBL主要由多种肠杆菌目细菌产生，能够水解青霉素类、头孢菌素类和单环类抗生素，但不能水解碳青霉烯类和头霉素类，其活性可被酶抑制剂抑制。ESBL多由质粒介导，主要酶型包括CTX-M、SHV、TEM、OXA等，氨基酸替代可产生多种亚型。CTX-M最为常见，根据氨基酸序列可分为5个主要类群:CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25。已出现对酶抑制剂耐药的CTX-M，如CTX-M-190和CTX-M-199。

AmpC酶由染色体或质粒介导，几乎所有的革兰氏阴性杆菌都可产生染色体介导的AmpC酶，最常见于肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等。AmpC酶能够水解第一代至第三代头孢菌素类（包括超广谱头孢菌素）和青霉素类，不能水解第四代头孢菌素和碳青霉烯类，耐受克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等酶抑制剂，可被阿维巴坦等新的酶抑制剂所抑制。通常AmpC酶表达水平较低，诱导表达后可介导广谱头孢菌素耐药。质粒介导的AmpC酶主要包括CMY、FOX、DHA、MOX、LAT、MIR和ACT等，国际上以CMY型多见，我国以DHA型和ACT型为主。高产AmpC酶联合孔蛋白缺失的菌株可能会导致碳青霉烯类抗生素耐药。

碳青霉烯类是治疗其他β- 内酰胺类耐药的革兰氏阴性菌感染的最后一道防线，而碳青霉烯酶的出现无疑给临床治疗带来了巨大的挑战。碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类及其他几乎所有的β- 内酰胺类抗生素，包括青霉素、头孢菌素、头霉素类等，并对多数酶抑制剂耐受。更为严重的是，携带碳青霉烯酶基因质粒的耐药菌存在潜在的暴发和传播的风险。临床常见的碳青霉烯酶包括A类（如KPC）、B类（如NDM、IMP、VIM等）和D类（如OXA-48、OXA-23和OXA-51等）。

A类碳青霉烯酶主要包括KPC、GES、IMI、SME等，可水解几乎所有的β- 内酰胺类抗生素。KPC-2是我国最常见的碳青霉烯酶，主要由质粒编码，多见于肺炎克雷伯菌。编码KPC酶的肺炎克雷伯菌已在世界各地暴发，在我国主要的流行克隆为ST11型。新型β- 内酰胺酶抑制剂阿维巴坦（Avibactam）、瑞来巴坦（Relebactam）、法硼巴坦（Vaborbactam）可抑制KPC酶的活性。

临床上较为常见的金属β- 内酰胺酶为NDM、IMP和VIM，几乎可以水解所有的β- 内酰胺类抗生素，但对氨曲南无水解活性，且金属酶活性不能被β- 内酰胺酶抑制剂抑制，但可以被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。柠檬酸NDM酶大多由肠杆菌目细菌和假单胞目不动杆菌属细菌产生，特别是大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌。编码NDM的基因常位于质粒上，具有水平转移能力，可能导致多重耐药菌株的蔓延。IMP和VIM基因常位于整合子元件中，主要由铜绿假单胞菌编码产生，但已播散至肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌和不动杆菌属等多种革兰氏阴性杆菌中。

OXA酶主要见于鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中，而肠杆菌目中较少见。我国鲍曼不动杆菌中以OXA-23型酶最为常见，主要由染色体编码。肠杆菌目细菌主要携带OXA-48家族的OXA-181型和OXA-232型酶等。大多数获得性OXA酶基因位于转座子元件上，具有快速变异和广泛传播的能力。虽然OXA酶水解碳青霉烯类的能力较弱，但它能与主动外排系统高表达或与孔蛋白缺失共同作用，造成碳青霉烯类耐药。

（二）氨基糖苷类钝化酶

氨基糖苷类钝化酶（aminoglycoside modifying enzyme，AME）是细菌对氨基糖苷类耐药的最重要原因。AME来源于某些细菌正常呼吸所需要的酶，根据生化反应的类型可分为三类:氨基糖苷磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferase，APH）、氨基糖苷核苷酸转移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT）以及氨基糖苷乙酰转移酶（aminoglycoside acetyltransferase，AAC）。AAC最为广泛，其次为APH和ANT。这些钝化酶共价修饰抗菌药物的氨基或羟基，使氨基糖苷类与核糖体16S rRNA不能紧密结合，从而无法发挥抗菌作用。AME基因可位于质粒、转座子和染色体上，通过可移动遗传元件在细菌间传播。

（三）四环素类灭活酶

四环素类灭活酶tet（X）为FAD和NADP依赖的单加氧酶（monooxygenase），可催化四环素类抗生素包括替加环素（Tigecycline）、依拉环素（Eravacycline）、奥玛环素（Omadacycline）等发生羟基化反应，导致药物结合核糖体16S rRNA的亲和力降低。tet（X）可由质粒或染色体编码，介导替加环素耐药，具有水平转移和播散的风险。目前已发现tet（X）有15种亚型，其中tet（X4）可导致替加环素耐药性较高。tet（X）的多种亚型已在临床分离的大肠埃希菌、不动杆菌属、柠檬酸杆菌属等细菌中发现，目前流行率较低。

（四）磷霉素灭活酶

磷霉素灭活酶FosA是Mn2+和K+依赖的谷胱甘肽 - S - 转移酶，可将谷胱甘肽转移至磷霉素的C1位上，导致环氧基团打开而失去抗菌活性。fosA基因主要存在于肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属细菌中，主要由质粒携带，常与多种耐药基因共存于同一质粒上。目前已发现fosA基因的10种亚型（fosA～fosA10）， fosA3最为常见，主要由大肠埃希菌携带。

二、抗菌药物作用靶位改变

由于抗菌药物作用靶点较特异，因此靶位的任何微小改变都将显著影响抗菌药物的结合。例如，β- 内酰胺类的作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillin binding protein，PBP），细菌通过改变PBP的结构降低β- 内酰胺类抗菌药物与其结合的亲和力，产生耐药性。革兰氏阴性菌中由PBP改变引起的耐药较革兰氏阳性菌少见，主要为流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌。

喹诺酮类是治疗医院和社区感染常使用的抗菌药物之一，它能够直接抑制细菌DNA的合成，作用靶点为两种拓扑异构酶，即DNA旋转酶（属于Ⅱ型拓扑异构酶）和Ⅳ型拓扑异构酶。前者由GyrA和GyrB两种亚基组成，后者由ParC和ParE组成。喹诺酮类药物靶点改变引起的耐药性由染色体介导。大多数高水平耐药临床菌株存在拓扑异构酶突变，且GyrA和ParC常存在不止一个突变位点。GyrB和ParE的突变较少见。

16S rRNA甲基化酶是肠杆菌目、铜绿假单胞菌和不动杆菌属对氨基糖苷类耐药的重要机制之一。16S rRNA甲基化酶能够介导16S rRNA的G1405或A1408位点甲基化，从而导致细菌对几乎所有氨基糖苷类药物高水平耐药。已报道的16S rRNA甲基化酶基因包括armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH和npmA，我国临床分离株主要检测到armA和rmtB。

可转移的黏菌素耐药基因mcr是革兰氏阴性杆菌对黏菌素耐药的重要机制之一。MCR是磷酸乙醇胺转移酶，可通过lipid A的磷酸乙醇胺修饰而降低细菌外膜的负电性，减少黏菌素与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的结合，从而导致细菌对黏菌素的耐受。目前已报道mcr基因的10种亚型（mcr-1～mcr-10）多位于转座子和质粒上，可造成耐药基因种内和种间的水平转移。

三、细菌外膜通透性改变

革兰氏阴性菌的细胞外膜上存在多种孔蛋白，是营养物质和亲水性抗菌药物的通道。孔蛋白表达下降、类型转换或结构突变均能够阻止亲水性抗菌药物进入细菌细胞内，影响药物的敏感性，进而产生耐药。β- 内酰胺类、喹诺酮类及四环素类等抗菌药物的敏感性与肠杆菌目细菌的非特异性孔蛋白OmpC和OmpF亚类缺失存在密切相关。研究显示，细菌产ESBL或AmpC酶联合孔蛋白缺失，可导致肠杆菌目细菌对碳青霉烯类耐药。

四、细菌外排系统的作用

主动外排系统也是革兰氏阴性菌多重耐药的重要机制之一。根据氨基酸序列的同源性，可将外排泵分为6个超家族，包括RND家族、MFS家族、MATE家族、SMR家族、ABC家族和PACE家族，其中以RND家族最为常见，其可由染色体或质粒编码。铜绿假单胞菌的外排泵包括MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM等。鲍曼不动杆菌中也存在不同类型的RND外排系统如AdeABC、AdeFGH和AdeIJK等，这些系统能够降低氨基糖苷类、氟喹诺酮类、β- 内酰胺类、四环素类、黏菌素和氯霉素的敏感性。AcrAB-TolC是肠杆菌目细菌最主要的外排泵，其过度表达与抗菌药物的多重耐药性有关。

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（王　辉　倪语星）