第一节 耐药结核病的常规检测方法及其评价
近年来，结核分枝杆菌耐药性问题日趋严重，已经成为国内外结核病控制中亟待解决的问题。我国是结核病高耐药国家，第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示：肺结核患者痰标本的分离菌株对4种一线抗结核药物的任一耐药率为36.8%，耐多药率为6.8%。由于不规范治疗是产生耐药和耐多药结核病的根本原因，而规范化的治疗方案又取决于准确快速的耐药结核病诊断方法。耐药结核病的常规检测方法主要是表型药敏试验（phenotypic drug sensitivity test，PDST），包括固体药敏试验（比例法和绝对浓度法）和液体药敏试验。结核分枝杆菌传统药敏试验如固体药敏试验是在含一定药物浓度的固体培养基上接种一定数量的分枝杆菌，当分枝杆菌能在该培养基上生长时被界定为耐药菌株，反之则定为敏感菌株。
一、固体药敏试验
固体药敏试验方法包括传统的绝对浓度法和比例法，绝对浓度法是我国30多年来各级实验室普遍沿用的方法，比例法是WHO推荐的结核分枝杆菌药物敏感性检测的“金标准”。这两种方法都可以使用直接法和间接法的药敏试验。直接法是将临床标本进行前处理后，直接接种到对照和含药培养基上的药敏试验方法，它适用于标本经抗酸涂片镜检含菌量较大的标本，由于直接法药敏的影响因素较多，现在越来越少使用。间接法是先对临床标本进行分离培养，得到菌株后再进行药敏试验的方法。虽然间接法获得结果的时间比直接法长，但间接法对菌量控制较容易，结果较准确，污染率低，故本节主要介绍间接法的比例法和绝对浓度法。
（一）比例法药敏试验
比例法是1996年WHO在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室使用的方法。该方法是接种两种不同浓度的菌液在两支相同浓度的罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长的菌落数，计算耐药百分比，从而确定测试菌株对该药的耐药性。由于比例法是通过计算耐药菌比例来解释结果的，对药敏试验中的重要变异因素——接种量进行了一定程度的校正，故结果较绝对浓度法更为稳定。
1.试验原理
在含一定药物浓度的固体培养基上接种一定数量的分枝杆菌，当分枝杆菌能在抑制其生长的MIC下生长时被界定为耐药菌株，反之则界定为敏感，比例法通过计算耐药菌比例来解释结果。
2.菌株选择
应尽量选择新鲜的原代纯培养物进行药敏试验，若培养物老化或有污染，则不能直接用于药敏试验操作。生长老化的菌落需要进行传代，待菌株重新恢复到对数生长期方可进行药敏试验；有部分杂菌污染的菌落，需要对菌株进行去污染前处理后传代，待获得纯培养物之后才能进行药敏试验。
3.操作方法
先在磨菌瓶中加入1～2滴10%的吐温生理盐水，用无菌接种环刮取2～3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中；在旋涡振荡器上振荡10～20s，静止5min，用生理盐水悬浮，静止片刻取上清比浊至1mg/ml菌液，将该菌液稀释为10-2mg/ml菌液和10-4mg/ml菌液；用22 SWG标准接种环将不同浓度菌液均匀接种一满环（即0.01ml）至对照及含药培养基表面，37℃恒温培养，4周后报告结果。
4.结果判读
根据含药培养基和对照培养基上菌落生长的数量来计算耐药百分比，耐药百分比 ＞ 1%，则受试菌株对该药耐药； ≤ 1%则为敏感。（耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%）
5.注意事项
（1）操作过程要严格按照标准操作规程操作，严格把关对照培养基、含药培养基及试验菌株的质量、严格监控孵箱及冰箱等的温度。
（2）每批试验以结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv全敏株）检测含药培养基的质量、稀释和接种量等因素。
（3）为避免由传代引起的可能变异，原则上使用原代分离培养物的新鲜菌落进行药敏试验。
（4）试验中若高浓度对照培养基上生长的菌落数少于20个，则应从对照管中挑取菌落重复试验。
（二）绝对浓度法药敏试验
绝对浓度法药敏试验是19世纪60年代以来我国各级实验室普遍沿用的方法，该法是在对照培养基和两支含不同药物浓度的罗氏培养基上接种一定量同一浓度（10-2mg/ml）的菌液，最后计数对照、含药培养基上菌落的数量，在对照培养基菌落生长良好的前提下，含药培养基上菌落数量大于20个即为耐药。该法操作及结果判读简单，而且可以判定不同药物浓度耐药，在医院实验室得以广泛应用。但对接种量及菌悬液的制备浓度要求较高，不同操作者的操作可能差异较大。
1.试验原理
在含一定药物的固体培养基上接种一定数量的分枝杆菌，当分枝杆菌能在抑制其生长的MIC下生长时被界定为耐药菌株，反之则界定为敏感菌株，绝对浓度法接种于含不同药物浓度的培养基。
2.菌株选择
同比例法。
3.操作方法
将试验菌株磨菌比浊得到1mg/ml菌液（同比例法），用0.5ml无菌吸管吸取0.5ml菌液，移至预先准备好的4.5ml灭菌生理盐水试管中，即稀释成10-1mg/ml菌液；用相同方法再进行10倍稀释，即成10-2mg/ml菌液。用一次性无菌吸管准确吸取0.1ml菌悬液分别接种于对照、高浓度和低浓度含药培养基斜面上，旋转培养基使菌液铺满整个斜面，每管接种菌量约为10-3mg，然后置于37℃孵箱内保持斜面水平放置24h后，直立继续培养至4周后观察结果。
4.结果判读
在对照培养基菌落生长良好的情况下，以低浓度含药培养基菌落生长数 ＞ 20个为耐药；若对照培养基菌落生长良好的情况下，低浓度含药培养基斜面无菌落生长则为敏感。若对照培养基菌落生长数 ≤ 20个则需重复药敏试验。
5.注意事项
同比例法。
（三）方法学评价
比例法和绝对浓度法是目前普遍应用的分枝杆菌药物敏感性测定常规方法。国内多数文献报道按照WHO规定的绝对浓度法进行药敏试验，结果与比例法的差异无统计学意义。刘宇红等研究表明比例法和绝对浓度法结果存在明显差异的药物是异烟肼和乙胺丁醇，而浓度界限接近的利福平则差异不明显，有差异的菌株MIC均在比例法和绝对浓度法浓度界限之间。说明两种检测方法之间主要差异为耐药界限。有研究报道，异烟肼和乙胺丁醇两种方法的符合率均为80%以上，而链霉素和利福平的符合率均为90%以上，但比例法检测出的耐药率明显高于绝对浓度法，因此，为了更好地与国际接轨，便于信息交流，建议有条件的实验室可以开展比例法药物敏感性试验。目前，我国大多数结核病实验室使用比例法，使用绝对浓度法的实验室越来越少。虽然传统固体药敏试验方法如比例法和绝对浓度法为比较成熟的技术，也是耐药结核病的常规检测方法，但操作较为复杂，影响因素较多，主要存在以下问题：①需时久，4周才能获得结果；②准确性低，与临床符合率差；③操作繁琐，传播风险大。因此，传统固体药敏试验方法越来越不能满足临床诊治需求，急需新的药敏检测方法。
二、液体药敏试验
（一）BACTEC MGIT 960 系统
BACTEC MGIT 960系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。该仪器通过连续检测接种标本的MGIT分枝杆菌生长指示管所显示的荧光强度的变化从而判断是否有分枝杆菌生长。该方法是用类似于比例法的原理进行分枝杆菌的药物敏感性试验，其试验判断的临界度也为1%，该方法药敏实验平均所需时间为7～10d。与 BACTEC 460TB 系统比较，BACTEC MGIT 960 系统具有无放射性污染、可做二线抗结核药物的药敏试验等优点。
1.试验原理
BACTEC MGIT 960系统包含一种分枝杆菌培养管（MGIT），管内为Middle brook 7H9液体培养基，其原理是在培养管内的液体培养基中加入一种O2敏感的荧光钌复合物，正常情况下管内的荧光能被溶解于培养基中的O2所抑制。若培养管内有细菌生长时，培养管中的O2将被细菌消耗，同时荧光被激发。在长波紫外灯或紫外透射仪365nm处可观测产生的荧光，如加入药物到培养管内的培养基中，若药物对分离的分枝杆菌有抗菌活性，则它会抑制细菌的生长并因而抑制荧光，而无药物对照的细菌生长不受抑制并会有荧光增加的现象。通过仪器来监测生长情况，该仪器会自动将结果解释为敏感或耐药。
2.试验方法
在其中一个MGIT管内加入已知浓度的供试药物，将管内细菌生长的情况与接种1/100稀释菌液的无药MGIT管（生长对照）进行比较。将接种后的含药培养管和对照管，按照BACTEC MGIT 960仪器操作步骤放入仪器，进行培养。
3.结果判读
仪器自动监测各管内分枝杆菌生长情况（GU值），自动报告敏感或耐药。
4.注意事项
（1）操作过程要严格按照标准操作规程操作。
（2）试验操作严格在Ⅱ级或以上生物安全柜内进行。
（3）每批试验以结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv全敏株）检测分枝杆菌培养管（MGIT）质量、稀释和接种量等因素。
（二）其他非放射性检测系统
近年来，除上述提到的BACTEC MGIT 960系统外，还有许多新的自动化检测系统（非放射性的）不断涌现，这些新的检测系统不断在临床推广应用。如Bact/Alert 3D系统、BACTEC 9000 MB系统和ESP Ⅱ培养系统，这些系统均是使用液体培养基和非侵入性的自动化检测仪器，且都不使用放射性试剂。
1.Bact/Alert 3D系统
是利用分枝杆菌生长过程会消耗O2释放CO2的原理，利用颜色感应器感应颜色的变化来判断分枝杆菌的生长状况，颜色感应器的工作原理是：颜色感应器会随着pH值的改变由绿色变为黄色，培养管CO2浓度随着细菌耗O2的增加而升高，H+浓度随着CO2浓度的升高而升高，从而使pH值改变。印度学者Nair等报道Bact/Alert 3D系统与罗氏比例法检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇、氨基糖苷类、环丙沙星（ciprofloxacin，Cpfx）的符合率分别为100.0%、91.5%、72.4%、100.0%、100.0%。其检测时间明显快于罗氏比例法，约为10d。目前，该系统是我国微生物培养系统中使用最多的一种，然而由于仪器及试剂的价格昂贵，其推广应用受到限制。
2.BACTEC 9000 MB系统
是采用液/固双相系统，利用氧特异性的感应器来监测分枝杆菌生长过程中O2浓度的变化来判断其生长情况。EPS Ⅱ系统是利用密封培养瓶中气体压力的变化，使用压力感应器来监测其变化，从而反映细菌生长情况，美国FDA认可EPS Ⅱ自动化检测系统可应用于各类微生物（包括分枝杆菌）。
（三）方法学评价
传统液体药敏试验如BACTEC MGIT 960系统药敏作为比例法药敏试验的一种，因培养和药敏检测到出报告的时间大大缩短，由4周缩短到4～14d，可以减少诊断延误，被越来越多的实验室采用。国外Siddiqi等报道用传统比例法与BACTEC MGIT 960系统药物敏感性试验检测链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇的符合率分别为92.5%、100.0%、99.2%、93.3%，BACTEC MGIT 960系统药物敏感性试验报告时间为4～13d。国内陈忠南等以比例法为金标准，得到BACTEC MGIT 960法检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺（ethionamide，Eto）的准确度分别为：99.0%、96.0%、99.0%、96.0%、100.0%、99.0%、96.0%、94.0%。全自动 BACTEC MGIT 960系统是目前较为理想的快速培养系统，也是目前国际公认的液体培养耐药性检测系统，该检测系统具有敏感性高、仪器化、准确、快速等优点，但该系统需专用设备和专用试剂，成本较高，因此，限制了液体药敏方法的广泛推广，尤其是在中低收入国家或地区。目前，我国的结核病专科医院一般会使用该系统检测分枝杆菌耐药性，但综合性医院使用比较少。