第二节　耐药结核病的快速检测方法及其评价

耐药结核病常规检测方法绝大多数需要MTB纯培养物，其生长慢的特性决定了该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导致结果的不确定性。因此，为了满足临床治疗的需求，近年来，一些新型的快速药敏方法如微量药敏MIC检测及MODS等技术发展迅速。

一、微孔板药敏检测技术

（一）不依赖显色剂的微量MIC药敏检测技术

微量MIC药敏检测技术是一种新的耐多药结核病的快速检测方法，是一种基于在液体培养基中进行的比例法测定药物的最低抑菌浓度，是将一定量的结核分枝杆菌接种于96孔微孔板内，孔内分别包被有连续稀释的不同抗结核药物，培养7d后，观察微孔内形成的细菌颗粒，从而判断结核分枝杆菌对不同药物的MIC值，准确获得药物敏感性结果。日本结核病研究所已将该技术成功的用于结核分枝杆菌的耐药性测定；我国上海市肺科医院、上海市结核病（肺）重点实验室王洁等，建立了用微量MIC值判断结核分枝杆菌药物敏感性的方法，徐园红等应用该方法进行了初步的临床应用评价（图2-1）；专家推荐非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）在缺乏肯定的体外药敏试验方法前，建议体外药敏试验以MIC法检测菌株的耐药程度（图2-2），因此微量药敏MIC检测技术也是目前较认可的一种检测NTM的药敏试验方法。

微量MIC药敏检测技术可以根据用户需求布局药物种类及药物浓度，包括一些新型的抗结核药物，如莫西沙星（moxifloxacin，Mfx），克拉霉素（clarithromycin，Clr），阿莫西林 -克拉维酸钾（amoxicillin-potassium clavulanate，Amx-Clv）、氯法齐明（clofazimine，Cfz）等。但是该法结果判读存在较大的主观性，特别是NTM和污染菌不容易区分（图2-2），且分枝杆菌是否生长及生长的速度直接受液体培养基质量影响，生物安全隐患较大，这影响了其商品化试剂的生产和研发。

（二）依赖显色剂MIC快速检测方法

依赖显色剂MIC快速检测方法的原理为在MIC测定体系中加入某些显色剂，只要有细菌生长显色剂即发生颜色变化，因此根据颜色变化来判断是否有细菌生长和细菌的耐药性。

传统的结核分枝杆菌药物敏感性检测——快速显色法有以下三种。

1.刃天青法（rosazurin microtitre assay）

在不依赖显色剂 MIC 快速检测法结果判读前，加入指示剂刃天青，当细菌生长时，指示剂由蓝色变为粉色。

2.阿拉莫尔蓝法（alamar blue microtitre assay）

结果判读前加入指示剂阿拉莫尔蓝，该指示剂是一种氧化还原指示剂，如果其颜色由蓝色变为粉色则说明有细菌生长（图2-3）。

3.MTT（microtitre，MTT）法

培养结束后加入氧化还原指示剂MTT，当有细菌生长时，指示剂颜色从黄色变为紫色。

这些方法不需要特殊的仪器，操作简单，已有很多成功应用显色法检测药物敏感性的报道。

（三）方法学评价

微孔板法药敏试验是一种新的耐多药结核病的快速检测药敏方法，该检测技术操作简单，无需特殊仪器设备，7～10d就可获得10余种抗结核药物的MIC测定结果，较常规药敏试验快速、简便、成本低，可在各基层单位推广应用。但该法结果判读存在较大的主观性，且分枝杆菌是否生长及生长的速度直接受液体培养基质量影响，生物安全隐患较大，这影响了其商品化试剂的生产和研发。徐园红等以绝对浓度法为金标准对四川地区192株临床MTB的微量药敏检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素的准确性分别达85.9%、72.9%、97.4%、85.9%、84.9%、83.9%和72.9%。王芝等报道微量MIC药敏检测法与比例法检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、卷曲霉素、阿米卡星和卡那霉素的一致率分别为95.0%、95.9%、98.6%、94.5%、94.5%、95.9%、99.1%、95.0%、93.2%和98.2%。杨翰等报道以MGIT 960法为标准，微孔板法对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇等4种药品的敏感度、特异度、Kappa值分别为88.7%（63/71）、100.0%（260/260）、0.93，93.9%（77/82）、98.8%（246/249）、0.94，93.8%（45/48）、99.6%（282/283）、0.95，66.7%（14/21）、99.0%（307/310）、0.72。微孔板法对一线抗结核药物的耐药性检测操作简便，与MGIT 960法一致性高，且可检测出低浓度耐药情况，可作为临床选择药物及使用剂量时的参考。

微量MIC药敏检测技术与传统比例法相比可以提供更确切的耐药信息，MIC不仅可以判断是否耐药，还能判断耐药的程度，因此，该方法是目前较理想的一种快速检测耐药结核分枝杆菌的诊断方法，具有较高的临床应用价值，已有多个商品化试剂。因此，越来越多的结核病专科医院使用微孔板药敏检测方法。

二、显微镜观察药物敏感度性技术

MODS技术是近年来建立的一种新的MTB耐药性检测技术，其原理是利用MTB在适宜的液体培养基中生长会形成的索状结构，且生长速度比固体培养基上快，把抗结核药物加入液体培养基中作为含药孔，未加入药物的液体培养基作为对照孔，耐药性判断依据是对照孔和含药孔中有无MTB特征性索状结构，使用倒置显微镜观察特征性索状结构来确定是否有MTB生长。

MODS技术是将液体培养药敏试验与倒置显微镜观察技术结合的一种耐药性检测技术。该技术具有快速、简便、价廉等特点。随后，国外及中国开展了该法的临床应用研究，显示了良好的前景，但目前该方法还未用于常规的临床检测。该法既可用于菌株的药敏检测，也可用于痰标本的快速培养，7d即可获得结果。但是药敏结果的时间和准确性受液体培养基质量的影响，早期结果观察时可能会出现人为因素的影响，特别是早期索状结构不典型时，观察结果人为因素影响较大，不容易质控及标准化。另外，由于是显微镜观察活菌，而生物安全柜内无法使用倒置显微镜，故每日观察结果都只能在生物安全柜外，生物安全隐患较大。

三、噬菌体生物扩增法

噬菌体生物扩增法是近年来建立的一种细菌学快速诊断新技术，其原理是特异性分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，未感染细菌的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖，并将菌体裂解，释放出子代噬菌体。释放出的噬菌体即可感染随后加入的指示细胞（一种快速生长的分枝杆菌），并将其裂解。指示细胞裂解后在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑，其噬菌斑形态见图2-4。该技术可用于MTB的耐药性检测，其原理为当抗结核药物与结核分枝杆菌作用一定时间后，敏感株因被抗结核药物杀死，耐药菌能继续生长，并被随后加入的噬菌体所感染，随后加入杀毒剂杀死未能感染结核分枝杆菌的噬菌体。而进入菌体内的噬菌体不受影响，从而在菌体内大量繁殖，并将结核分枝杆菌裂解，释放出的噬菌体可立即感染随后加入的耻垢分枝杆菌（指示菌）并使其裂解，由于指示菌繁殖迅速，所以24h观察到在培养皿上会出现明显噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及数量的多少即可判断待检菌株的耐药性，或待检标本中是否存在活的MTB。如菌株为耐药株，即可被噬菌体感染，噬菌体进入感染的菌体内，则随后加入的杀毒剂无法杀死菌体内的噬菌体，敏感株则相反。

在MTB表型药敏检测方法中，该法是目前最快的方法，2～3d可获得药敏检测结果，且该法不需特殊仪器、检测成本低，与常规方法符合率达85%以上。该方法除可用于涂片阳性痰标本的直接药敏检测，也可用于临床菌株的耐药性检测。国外学者应用该法检测MTB药物敏感性，并与快速培养药物敏感性和DNA测序法的药敏结果进行比较，结果证明此法在检测MTB药物敏感性方面具有独特优越性。该法的生物安全性高，可降低操作者被感染的风险，因为该法是将耐药菌裂解，但该法容易污染、操作繁琐、易受噬菌体数量、活性和指示细菌活性影响。此外由于该法检测的是活菌，因此有可能作为评估抗结核疗效的一种手段，但尚需进一步研究证实其在监测抗结核药物治疗效果中的作用。