第五节　其他辅助生殖衍生技术

一、深低温冷冻技术

生殖细胞的深低温冷冻技术是将生殖细胞或组织置于冷冻保护剂中，通过脱水并降温，最终使细胞或组织在深低温条件下呈玻璃化状态，确保低温保存下存活的操作过程。当冷冻的生殖细胞或组织在临床治疗中需要使用时，可通过逐步移除冷冻保护剂，实现复苏和利用。常用的深低温冷冻方法主要包括程序化冷冻和玻璃化冷冻，目前已广泛应用于精子、卵子、胚胎以及卵巢和睾丸组织的保存，是生殖细胞长期保存的安全方法。

（一）精子和卵子冷冻

1.卵子的冷冻

可用于卵子库的建立、肿瘤患者放化疗治疗前卵子保存、治疗过程中因各种原因不能获得安全有效的精子而采取的应急保存等。由于卵子细胞大小和成分的特殊性，对其冷冻的技术要求较高，应用程序化冷冻法进行卵子冷冻存活率较低。玻璃化冷冻法是目前常用的卵子冷冻手段，复苏率已达到较满意的水平。

2.精子的冷冻

可应用于：①精子库的建立；②肿瘤患者放化疗治疗前精子保存；③取精困难者预存精子；④各种原因的精子获得困难者精子的预存，如睾丸手术获得的精子及隐匿性无精子症的精子。常规的精子冷冻方法简单，在生殖治疗机构广泛应用。近年来针对稀少精子或睾丸组织取精等人群开展的稀少精子冷冻和单精子冷冻，大大提高了精子的利用效率，有效解决了获取精子困难男性的生育问题。

（二）胚胎冷冻

控制性超促排卵技术主导下的辅助生殖技术常出现胚胎和子宫内膜发育不同步的现象，不孕女性的子宫内膜疾病也可造成胚胎种植困难，上述人群未进行充分的内膜准备使胚胎种植机会降低，造成胚胎浪费，对获得的胚胎进行冷冻可为内膜准备提供充足的时间。另外，辅助生殖治疗常收获较多的胚胎，移植后剩余胚胎的冻存利用可大大提高取卵周期的累计妊娠率。因此胚胎的冷冻技术是对辅助生殖治疗技术的极大补充和完善，也是开展辅助生殖治疗必备的技术。

胚胎冷冻方法主要包括程序化冷冻技术和玻璃化冷冻技术。程序化冷冻法是通过在不同浓度的冷冻保护剂和不断缓慢下降的温度下，完成细胞的脱水并形成玻璃态，实现冷冻保存。该方法是早年胚胎冷冻的主要方法，但由于方法学自身因素及在操作过程中对避免冰晶形成环节的技术要求较高，容易出现技术性胚胎损伤或死亡。玻璃化冷冻技术高浓度冷冻保护剂的使用，有效解决了困扰胚胎冷冻的冰晶形成及由此带来的胚胎损伤问题，大大提高了胚胎的存活率，已成为目前胚胎冷冻的主要方法。

（三）卵巢组织的冷冻技术

卵巢组织冷冻主要应用于肿瘤放化疗前、各种原因的外伤造成卵巢切除患者的卵巢组织保存。首例来自冷冻卵巢组织的婴儿于2004年出生，近年来由于肿瘤的高发及年轻化趋势，使卵巢组织冷冻技术开展的前景受到重视。

与胚胎冷冻技术一样，目前使用卵巢组织冷冻方法也包括玻璃化冷冻和程序化冷冻两种，目前出生的婴儿多数来自程序化冷冻的卵巢组织。但随着玻璃化冷冻技术应用中相关程序的进一步完善，玻璃化冷冻技术细胞高存活率的优势日益凸显，其应用比例也日益提高。

二、辅助孵化技术

囊胚孵出困难造成种植失败是降低辅助生殖技术治疗成功率的一个重要因素，辅助生殖治疗技术可在多个方面影响透明带的功能，比如促排卵治疗造成的高激素状态、体外培养过程以及胚胎冷冻和复苏过程均可造成透明带硬化；体外培养获得胚胎发育潜力降低也造成囊胚孵出困难。此外，女性年龄增长和个体卵子因素可以造成透明带结构和功能异常，影响囊胚孵出。应用近红外激光技术、机械切割等手段对透明带进行辅助孵化，造成透明带厚度减小或者直接使透明带形成小孔，可使形成的囊胚容易从透明带中孵出，增加囊胚种植的可能。

三、卵母细胞体外成熟

该技术主要应用于PCOS卵巢高反应人群预防促排卵治疗出现多个卵泡生长引起的OHSS、卵巢组织冷冻技术中不成熟卵子的体外成熟、体内促性腺激素不敏感者、激素敏感性肿瘤的辅助生殖治疗。通过取出卵巢内的不成熟卵母细胞，在体外给予合适的成熟培养条件使其完全成熟，然后通过体外受精获得胚胎并进行移植，实现生育。

四、卵母细胞体外激活

精子和卵子的相互激活是实现受精的重要条件，其中Ca2+的振荡频率和强度起到重要作用，对于Ca2+振荡强度不足引起的受精困难，通过给予Ca2+载体增加细胞外离子向卵细胞内转移、调动细胞内储备Ca2+的释放，使细胞质Ca2+振荡的频率增加、强度增强，从而激活卵子。常用的激活剂包括钙离子载体A23187、锶氯化物等。

五、卵母细胞重构技术

卵子细胞器功能障碍可降低生育能力，并也可导致多种细胞器因素疾病的发生，并且根治困难。目前解决细胞器功能障碍最有效的手段是卵母细胞重构技术，通过胞质置换、核置换、细胞器移植等技术，重构一个健康的卵子，实现生育正常后代的目的。

（徐维海　舒　静）