第四节　体外受精-胚胎移植技术

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），俗称试管婴儿，是指将女性卵子与男性精子分别取出体外后，置于培养液中使其受精并发育成胚胎，再将胚胎置入母体子宫内发育成胎儿。根据技术的发展历程以及受精方法、治疗对象的不同，可分为三代试管婴儿技术。第一代试管婴儿技术，即传统的IVF-ET，是指将卵子和精子取出后在体外受精培养皿中进行自然的受精，然后将受精后的胚胎移植到宫腔，避开了生理情况下精子与卵子在输卵管结合的过程，主要适用于女性输卵管不通的患者，由英国科学家Steptoe和Edwards在1978年首先开辟应用。第二代试管婴儿技术，即卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术，是指将卵子和精子取出后，通过显微穿刺针的方式将精子直接注射入卵子进行受精，主要是适用于少精子症、弱精子症、畸形精子症等诸多男性因素引发的不育问题，由比利时科学家Palermo在1992年首次成功应用。近年来，随着分子生物学技术的发展，胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）开始发展并应用于临床，俗称第三代试管婴儿技术。该技术是在第一代和第二代试管婴儿技术基础上派生出来的一项新技术，即在体外培育的胚胎植入前，对囊胚进行细胞活检，以检查是否携带异常基因或存在染色体异常，以排除有家族遗传病史的染色体或基因异常，从而达到优生的目的。

IVF-ET技术过程包括控制性超促排卵（控制性卵巢刺激）、取卵、精液获取、体外受精与胚胎移植环节，体外受精环节又包括常规体外受精（IVF）和卵胞质内单精子注射（ICSI）两种方式（图3-4-1）。PGT则增加了囊胚活检进行遗传学诊断的步骤，大体过程是在将胚胎移植到母体子宫前，先从每个胚胎取少量细胞检测其染色体或基因情况，检测合格的胚胎才被移植。

一、适应证与禁忌证

（一）适应证

1.女方各种因素导致的配子运输障碍

（1）炎症引起的输卵管阻塞或通而不畅。

（2）双侧输卵管切除。

（3）输卵管结扎术后或复通后妊娠失败。

2.顽固性排卵障碍

（1）诱导排卵或温和卵巢刺激6次以上仍不排卵。

（2）促排卵后有排卵6次未孕。

（3）结合宫内人工授精技术3次治疗后仍未获妊娠者。

（4）未破卵泡黄素化综合征。

3.子宫内膜异位症和子宫腺肌病

（1）子宫内膜异位症Ⅲ、Ⅳ期合并EFI低于5分者。

（2）Ⅰ、Ⅱ期经手术治疗后试孕6~12个月未获妊娠者。

（3）子宫内膜异位症合并生殖高龄或卵巢低储备者。

（4）子宫腺肌病合并不孕患者。

4.男方因素

（1）少精子症：5×106/ml≤精子浓度<10×106/ml，可考虑行AIH-IUI或IVF治疗；1×106/ml≤精子浓度<5×106/ml，可考虑行IVF或ICSI治疗；精子浓度<1×106/ml，直接行ICSI治疗。

（2）弱精子症：轻度弱精子症（20%≤前向运动百分率<32%）选择AIH-IUI；中度弱精子症（10%≤前向运动百分率<20%）选择AIH-IUI或IVF；重度弱精子症（1%≤前向运动百分率<10%）选择IVF或ICSI；极重度弱精子症（前向运动百分率<1%）选择ICSI。

（3）畸形精子症：轻度畸形精子症（3%~4%）可采用AIH-IUI助孕；中重度畸形精子症（1%~<3%）选择AIH-IUI或者IVF；极重度畸形精子症（<1%）选择ICSI。

（4）上述少精子症、弱精子症、畸形精子症经3次宫内人工授精技术治疗仍未获得妊娠。

5.遗传因素

由于遗传性疾病需行植入前诊断，如血友病、地中海贫血等。

6.免疫性不孕症

排除其他不孕因素，如男方精液或女性宫颈黏液内存在抗精子抗体者、卵巢自身免疫者、透明带免疫者等。这些患者在其他治疗无效时可行体外受精。

7.原因不明性不孕

经过人工授精3个周期以上仍未妊娠者。合并卵巢低储备（AMH≤1.1）、生殖高龄（>38岁）、不孕年限超过3年或合并其他可能降低生育力的疾病者，可以适当减少人工授精周期数或直接转体外受精。

8.生育力保存

（1）女性癌症患者化疗或放疗前的胚胎冻存。

（2）男性癌症患者化疗或放疗前的胚胎冻存。

（二）禁忌证

1.男女任何一方患有严重的精神疾病、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病。

2.患有《中华人民共和国母婴保健法》规定的不宜生育的、目前无法进行胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病。

3.男女任何一方具有酗酒、吸毒等严重不良嗜好。

4.男女任何一方接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用期。

5.女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。

二、术前评估

为使不孕不育的夫妇能安全地分娩健康的下一代，对要求进行IVF治疗的不育夫妇在进入IVF-ET治疗流程之前，需进行系统的评估和检查，以明确不孕原因，确定治疗方案，确认患者具备恰当的IVF/ICSI适应证而无禁忌证。

1.男方检查

（1）精液检查［参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）标准］。

（2）生殖内分泌功能检查及染色体检查：反复多次精液检查提示少精子症、弱精子症或畸形精子症者需性激素测定。外周血染色体检查可排除因染色体异常所致的生精障碍。有条件者，加做Y染色体微缺失分析。

（3）睾丸活检：无精子症患者应进行男科体检及评估睾丸穿刺的价值，如穿刺有成熟精子，可行经皮睾丸穿刺取精卵胞质内单精子注射（TESA-ICSI）。

2.女方检查

（1）排卵的评估：

通过月经史大致了解患者是否有排卵；也可以通过抽血查孕酮（P）水平，如P>3ng/ml则表示该周期有排卵；基础体温如提示双相型且高温相持续12天以上表示有排卵；尿LH检测如出现阳性亦提示有排卵可能；超声下连续监测卵泡生长发育可作为是否有排卵的直观检查。

（2）卵巢储备功能的评估：

抗米勒管激素（AMH）、月经来潮第2~3天进行基础生殖内分泌功能测定和超声下双侧卵巢窦卵泡计数（AFC）。

（3）输卵管通畅性的评估：

应在男方精液检查及女方排卵评估之后进行，选择月经干净3~7天避开性生活后进行，通常选择X线下子宫输卵管造影或超声下子宫输卵管造影等，因后者具备可同时观察子宫及宫腔内病变的优势，近年来得到越来越多的应用。如造影仍不能明确者建议可能宫腹腔镜联合探查术。

（4）子宫内膜容受性的检查：

内膜活检不作为首选，近年来随着超声技术的蓬勃发展和亚专科化建设，超声下子宫内膜容受性的检查应用越来越广泛，包括宫腔容积、内膜厚度、内膜病变、内膜下血供等多方面综合评估。

（5）重要器官功能检查：

为保证药物使用的安全性及妇女妊娠后的健康，在IVF治疗前应进行常规检查，包括血常规、尿常规、肝功能、肾功能、甲状腺功能、胸部X线检查、乳腺检查、心电图、宫颈癌筛查等。

三、IVF控制性超促排卵及卵泡监测

（一）控制性超促排卵的目的

IVF过程中控制性超促排卵是在药物作用下使IVF周期中有多个卵泡发育，以一次获取较多的卵子，得到较多可供移植的胚胎。

（二）控制性超促排卵前的卵巢反应性评估

治疗前需根据患者的年龄、基础性激素状态和窦卵泡计数等对卵巢反应性进行充分的评估。其目的是：①预测卵巢对外源性促性腺激素（Gn）刺激的反应性，指导Gn的应用剂量；②预测进行体外受精时的获卵数目；③预测OHSS发生风险；④预测妊娠率；⑤预测活产率。

1.年龄

年龄是预测卵巢储备和反应性的首选粗略标准。年龄超过38岁预示卵巢储备下降，年龄超过40岁是公认的卵巢低反应高危因素。年龄是预测卵子质量的较好指标，高龄尤其是>40岁卵子质量下降，将明显影响IVF的妊娠结局。

2.基础生殖激素

（1）基础FSH水平：

指自然月经周期第2~3天（即卵泡早期）的血清FSH水平。妇女的基础FSH水平在不同月经周期可能有所波动，并受多种因素包括抑制素、活化素、雌激素和卵泡抑制素的调节；FSH水平正常≤8IU/L，为卵巢正常反应；若基础FSH水平>8~10IU/L，预示卵巢低反应。

（2）基础E₂水平：

指自然月经周期第2~3天期间的血清E₂水平。基础E₂水平升高提示卵巢储备降低，预测卵巢低反应的基础血清E₂值大于50ng/L。

（3）基础FSH/LH：

基础FSH/LH比值≥2.0，对促排卵反应较差，周期取消率增加；LH水平降低可能影响卵巢对Gn的反应，在COS中需要添加LH。

3.颗粒细胞分泌蛋白的测定

（1）抑制素B（INH B）：

卵巢储备功能减退者基础INH B的降低早于基础FSH的升高，故认为INH B比FSH更能敏感反映卵巢储备，但对卵巢反应性也仅有中度预测能力。基础INH B阈值并无统一标准，文献报道大多为<40ng/L至56ng/L之间，INH B水平还受个体脂肪量的影响；INH B有周期内变异，在COS周期INH B受Gn调控，故测定INH B可对卵巢反应性做出及时评价。

（2）抗米勒管激素（AMH）：

AMH<1.1ng/ml是卵巢低反应的风险因素；AMH在月经周期中保持较恒定的水平，既能在卵泡期又能在黄体期进行测定，不受Gn的调控。

4.卵巢超声检查

（1）基础窦卵泡计数（AFC）：

基础AFC系早卵泡期阴道超声下检测到的直径2~10mm的窦卵泡数目，直接反映本周期募集到的卵子数，间接反映卵泡池中剩余的原始卵泡数。双侧基础AFC合计<7个是卵巢低反应的风险因素。AFC受避孕药、GnRH-a及操作者等影响，也存在周期内和周期间变异。对年轻、有排卵的妇女，若AFC低，应谨慎解释，也许并不代表卵巢储备降低。年龄<35岁，AFC>15个的瘦型女性，发生卵巢过度刺激综合征的概率大。

（2）卵巢体积及平均卵巢直径（MOD）：

通用的卵巢体积的计算方法是经阴道超声测量卵巢3个平面的最大径线D1、D2和D3，体积V=D1×D2×D3×π/6。卵巢体积<3cm3，增加IVF的取消率。应用卵巢最大平面的平均卵巢直径（MOD）替代卵巢体积的测量，MOD与卵巢体积的相关性高达90%。以20mm作为MOD的界值，小于该值的患者IVF治疗结局较差。

（3）卵巢血流：

观测指标包括卵巢基质内动脉收缩期血流速度峰值（PSV）、阻力指数（RI）、搏动指数（PI）、收缩期/舒张期流速比值（S/D）等。原始卵泡无单独的血供，需由基质血管传输营养物质和激素。基础状态下卵巢基质血管收缩期PSV与卵巢反应性正相关。至少一侧未检测到卵巢间质基础血流考虑与卵巢低反应相关。在IVF治疗周期前测量卵巢基质的血流灌注情况，对预测卵巢反应性有参考价值，动态测定卵巢基质血流参数可能对卵巢反应性更有预测价值。

5.体重和既往促排卵反应情况

高体重和既往有低反应促排卵经历预示低反应风险；低体重和既往有高反应促排卵经历预示高反应风险。

6.卵巢刺激实验

（1）氯米芬刺激试验（CCCT）：

月经周期第5~9天每天口服氯米芬50mg，给药前后（即月经周期的第3天和第10天）检测血清FSH水平。卵巢储备和卵巢反应性良好的妇女，其卵巢生长发育的卵泡可产生足量的INH B和E₂对抗氯米芬激发的血FSH水平过度上升。若刺激周期第10天FSH水平>10IU/L或给药前后血清FSH水平之和>26IU/L，为CCCT异常，预示卵巢储备下降和卵巢低反应。

（2）外源性FSH卵巢储备试验（exogenous FSH ovarian reserve test, EFORT）：

也称FSH刺激试验（FSH challenge test，FCT），系在月经周期的第3天使用FSH 300IU，并在FSH给药前和给药后24小时分别采集标本检测血清E和/或INH B水平的卵巢刺激试验。若FSH刺激24小时后血清E₂水平的增值<100pmol/L和/或INH B水平的增值<100ng/L，为EFORT阴性（异常），预示卵巢储备下降和卵巢低反应。EFORT直接反映卵巢对FSH的敏感性，是预测卵巢反应性较准确的指标。EFORT对高反应的预测优于CCCT，CCCT对卵巢低反应的预测优于EFORT。

（3）GnRH-a刺激试验（GAST）：

GAST系在月经周期第2或3天早卵泡期使用超生理剂量的短效GnRH-a制剂1次，并在给药前和给药后24小时分别检测血清E₂水平。GnRH-a对垂体的短暂刺激作用，可使垂体分泌Gn增加，激发卵巢E₂的合成和分泌，使血E₂水平上升。若第3天的E₂较第2天的E₂增加1倍，考虑为卵巢储备功能正常。若在GnRH-a刺激24小时后血清E₂水平的增值<180pmol/L、血清E₂水平增幅<1倍或FSH水平>10IU/L、给药前后血清FSH水平之和>26IU/L，为GAST异常，预示卵巢储备下降和卵巢低反应。

卵巢高反应诊断标准：①COS过程中E₂>5 000pg/ml；②获卵数>15枚或由于卵泡数目过多取消周期；③COS过程中>12~14mm优势卵泡数目超过20个；④COS后出现中重度OHSS。高反应患者以预防卵巢过度刺激为主，推荐采用GnRH拮抗剂方案或GnRH-a长方案。

卵巢低反应（POR）诊断标准：博洛尼亚共识提出，需要至少满足以下3条中的2条可诊断POR。①高龄（≥40岁）或者存在卵巢反应不良的其他危险因素；②前次IVF周期中卵巢低反应，应用常规方案获卵数≤3个；③卵巢储备能力下降（AFC<5~7个或AMH<0.5~1.1ng/ml）。如果年龄或卵巢储备功能正常，患者连续两个周期最大化的卵巢刺激方案仍出现POR也可诊断。对于年龄≥40岁患者，卵巢储备功能检查异常，即AFC和/或AMH异常，在未行IVF周期之前，也应诊断为预期的（疑似的）POR。

（三）控制性超促排卵前的预处理

1.卵巢囊肿

可在COH前行腹腔镜下卵巢囊肿剔除术或者对于复发性卵巢囊肿可考虑B超引导下经阴道卵巢囊肿抽吸术。

2.输卵管积水

因输卵管积水可使胚胎种植率下降1倍，建议胚胎移植前处理除去积水。可以在COH前进行，也可选择冻胚移植前进行。去除方式可采纳输卵管切除、造口、阻断、穿刺。根据患者的卵巢功能和盆腔粘连状态决定。

3.子宫内膜病变

宫腔息肉可在COS前行宫腔镜手术，子宫内膜炎需要先抗炎治疗，若有病理提示异常增生需要按妇科规范进行治疗。

（四）控制性超促排卵常用方案

1.GnRH-a降调节方案

有长方案、短方案、超长方案、超短方案。

（1）长方案：

适用于预期卵巢正常反应患者。在启用Gn促排的前一周期的月经期、卵泡期或黄体中期（排卵后1周）开始应用GnRH-a（采用长效或短效GnRH-a制剂均可），一直持续至扳机日。患者降调节后，根据LH值调整剂量。在下一周期的第2天返诊检查FSH、LH、E₂水平，若FSH、LH均小于<5IU/L，E₂<50ng/ml，双侧卵巢内卵泡直径<5mm，内膜厚度<5mm提示降调节满意，可以开始给予外源Gn促排卵。一般剂量控制在150~300IU/d，根据卵泡个数、AMH值、体重、既往促排卵反应记录进行剂量调整。Gn注射3~4天后返诊进行卵泡监测，并查性激素LH、E₂评估卵泡发育情况和降调节情况，调整药物继续促排，酌情安排B超复查时间。一般Gn注射10~13天，当最大卵泡直径达18mm左右，评估整个卵泡群有效卵泡的最大募集数量再决定是否扳机。扳机时机的判断需要根据卵泡均匀性、促排卵的持续时间、卵泡的增长速度和雌孕激素水平综合而定。扳机日停用GnRH-a，酌情注射Gn，一般在晚上10~12点安排注射HCG。次日查血HCG、雌二醇、孕酮，扳机后34~36小时取卵。

（2）短方案：

利用了GnRH-a的短时间激发作用，一般适用于低反应患者。经典的短方案通常于月经的第2天开始应用短效GnRH-a 0.05~0.10mg/d至扳机日，同时于月经第3天开始给予Gn，以后根据卵巢的反应性调整Gn用量，根据卵泡发育情况决定HCG使用的时间（同长方案）。

（3）超短方案：

同样也是利用GnRH-a的激发作用，一般适用于卵巢低反应的患者。一般于月经的2~4天应用短效GnRH-a 0.1mg/d，于月经第3天开始给予Gn促排卵，以后根据卵巢的反应性调整Gn用量，根据卵泡发育情况决定扳机时机。

（4）超长方案：

常用于子宫内膜异位症、子宫腺肌病、高LH或高睾酮的PCOS患者，对低反应患者慎用。长效GnRH-a每28天注射1次（3.6mg或1.8mg），一般注射2~3次。末次肌内注射后第28~35天开始查血FSH、LH、E₂和B超。当血E₂达20~30pg/ml时、卵泡直径达4~5mm或FSH和LH开始升高，则可开始Gn启动。根据卵泡数确定Gn启动剂量，根据LH变化情况决定是否需要补充降调节。根据主导卵泡群个数、Gn使用时间、卵泡生长状况及E₂水平变化情况决定扳机日（同长方案）。

2.拮抗剂方案

采用GnRH-A来抑制垂体LH峰，作用迅速，用药时间较短。相较于GnRH-a，拮抗剂方案Gn用量少、时间短，卵巢过度刺激风险低，并未显著降低活产率；且对垂体降调节时间短，出现低雌激素症状少。目前临床上主导方案之一，预期卵巢正常反应、低反应或高反应患者均适用。

月经第2天查HCG、基础FSH、LH、E₂、P，B超检查无囊肿，血激素水平处于基础状态时，于月经第2~3天开始用Gn。根据患者年龄、卵巢功能及既往用药情况决定Gn剂量，一般150~225IU。GnRH-A可固定在Gn刺激后6~8天开始用，也可以根据患者的反应灵活应用，主导卵泡直径达14mm或者LH≥10IU/L或达基线水平2倍时，开始每天注射GnRH-A直至扳机日。目前拮抗剂均为短效，需要每日注射。决定扳机的条件同长方案。扳机可选择GnRH-a和/或HCG。有过度刺激倾向或拟继续黄体期促排的建议选择GnRH-a扳机。

3.微刺激方案

应用抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、低剂量外源性Gn联合或不联合GnRH-A控制LH峰，卵母细胞获得数目一般少于5~8个。

月经周期第3天开始口服CC 50~100mg/d（或LE 2.5~5.0mg/d），可同时联合使用Gn（一般不超过150IU），扳机日用HCG或GnRH-a，酌情可使用COX-2抑制剂（非甾体抗炎药）来预防卵泡提前破裂。32~36小时后经阴道超声引导下取卵。

4.其他方案

适用于卵巢低反应或既往促排周期卵子质量不佳更改方案选择。

（1）纯自然周期：

未用任何促排卵药和降调节药，自然LH峰后取卵。月经第6~8天开始监测卵泡生长，根据LH、E₂、PRG的值来判断是否扳机，决定取卵时机。

（2）改良自然周期：

月经周期第12天开始监测卵泡发育，当优势卵泡直径为12~17mm时使用GnRH-A来抑制提早出现的LH峰以及应用Gn来维持晚期卵泡的继续生长，当优势卵泡达到18~20mm时肌内注射HCG，若出现LH峰则24h后取卵，若未出现则36h后取卵，取卵后常规进行IVF-ET。

（3）黄体期促排：

排卵后1~3天内，卵巢内有3个左右<8mm的卵泡的患者，可使用此方案。黄体期促排需要的Gn量较大，一般用CC 50~100mg/d或LE 2.5mg/d协同Gn促排，Gn剂量150~300IU/d。若促排时间长，在黄体萎缩前加用甲羟孕酮10mg/d，以避免月经出血。雌激素的判断受孕酮的干扰。扳机日的选择主要根据卵泡大小，当3个卵泡到达18mm或1个卵泡到达20mm，使用GnRH-a扳机。对于POR患者还有一种双重刺激方案，即在卵泡期用微刺激方案促排，对直径大于17mm主导卵泡进行取卵；黄体期继续对直径小于13mm的卵泡行黄体期促排。此方案提高了周期内患者取卵数，对于临床预后较差、肿瘤患者生育力保存等时间较为紧迫的患者，有一定优势。

（五）控制性超促排卵方案的选择

1.高反应者以预防卵巢过度刺激为主，推荐采用GnRH拮抗剂方案、联合刺激、高孕激素下促排、微刺激方案，用GnRH-a扳机。

2.低反应者以尽量获得高质量卵子为主，推荐拮抗剂方案，也可选择联合刺激方案、GnRH-a短方案。微刺激、自然周期也可应用。根据患者卵泡发育特点进行个性化选择。

3.正常反应者首选黄体期或卵泡期长方案或拮抗剂方案，也可采用其他任何一种方案。

4.子宫内膜异位症若评估卵巢为正常反应，中重度子宫内膜异位症首周期推荐超长方案，IVF前应用GnRH-a 3~6个月可提高IVF成功率。若同时合并高反应风险或低储备推荐拮抗剂、高孕激素、联合刺激方案，冻存胚胎，再调整子宫内膜异位症不良盆腔环境后移植。

（六）排卵监测

控制性超促排卵过程中为避免卵巢过度刺激和提早排卵的风险，需要严密监测血清激素水平和卵巢超声检查。在运用Gn控制性超促排卵治疗时，临床医生可根据不同的需求和卵巢反应性，选择、维持或调整Gn用量，以后再重新评估，不断调整。

（七）扳机的选择和实施

1.扳机的时机

当卵泡直径有1个18mm以上，2个17mm以上，3个16mm以上，多数卵泡在14mm以上，平均每成熟卵泡E₂水平为200~300ng/L时，当天晚上10~12点注射HCG或GnRH-a扳机。扳机后36~38小时取卵。

2.扳机药物

（1）uHCG/rHCG：

uHCG 10 000IU及rHCG 250μg给药后32~36小时发生排卵。消除半衰期为（77.26±45.17）小时。

（2）GnRH-a：

注射曲普瑞林0.2mg，在给药48小时内LH上升10倍。其生物半衰期为（7.60±1.67）小时，可替代HCG诱发成熟卵泡排卵，尤其适合用于有过度刺激倾向或拟继续黄体期促排的患者，不可用于长方案。

（3）双扳机：

rHCG 250μg加GnRH-a 0.1mg，可同时增加内源和外源性LH，诱发排卵，并降低OHSS风险。

四、取卵

一般注射HCG和/或短效GnRH-a后34~36小时取卵，也可根据患者既往取卵、获卵的实际情况推迟或提前取卵时间。自发LH峰出现，取卵时机判断比较困难，可以参考LH、E₂、P的数值，由有经验的医生决定。超声引导下取卵术详见第二十四章第一节。

五、取卵日男方精液获取

（一）取精前准备

1.取精前应该有2天以上7天以内的禁欲时间，这个时间内不应该有任何遗精、手淫和性交发生。

2.取精前应避免影响精子质量的因素，如劳累、熬夜、抽烟、酗酒、感冒、服药、高温作业等。

3.为了取得干净的精液，应嘱咐患者在采精前排尿、清洗双手，采集过程中注意避免尿道、龟头和手上残留的细菌对精液的污染。

4.为了限制精液暴露于温度波动的环境时间过久影响精液质量以及出于伦理监督的原因，精液采集应该安排在邻近精液处理室的私密房间内采集标本，患者着无口袋衣服指纹核对身份后进入。

（二）精液的获取

一般采用手淫法采集标本，精液射入专用容器内，该批次容器应被验证过对精子无毒性。标本容器应该保持在20℃~37℃环境中，以避免精子射入容器后，由于大幅度的温度变化对精子产生影响。容器上必须标记患者姓名、编码、采集日期和时间，如果标本不完整，尤其是富含精子的初始部分丢失时，要在记录单上注明。如果精液量太少可以通过分段取精法留取精液。精液标本可能含有危险的传染性病原体，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）、肝炎病毒或者单纯疱疹病毒，因此应视为生物危险品处理。处理标本过程中必须使用无菌物品和无菌技术，严格遵守实验室规范。

六、实验室操作

1.精子的优化处理

精子优化处理方式根据精子的来源和精液质量决定，一般正常的精液多采用密度梯度离心法进行处理，少精子症患者的精液采用直接离心法进行处理。

2.拾卵

接受负压穿刺下获取的卵泡液，迅速转移至平皿中，在体视显微镜下快速寻找卵冠丘复合体（COCs），然后将找到的COCs经受精培养液漂洗后，转移至受精培养皿中，置入培养箱内备受精。

3.受精

在HCG注射后39~40小时，按2 000精子/卵在COCs周围加入精子，让精子和卵子在受精培养皿中进行自然受精。卵胞质内单精子注射（ICSI）受精方式详见本节第九部分。

4.受精、胚胎培养和发育观察

（1）受精后16~18小时，用合适口径的剥卵针脱除颗粒细胞，转至卵裂培养液中（ICSI直接转入卵裂培养皿），在倒置显微镜下观察受精情况，确定原核数。

（2）第2天和第3天晨观察胚胎卵裂情况，包括卵裂球数目和均匀度、碎片比例以及是否存在其他异常结构。

（3）对于需要囊胚培养者，在第3天将胚胎转入囊胚培养液中。继续培养至第5~6天，观察囊胚形成情况，并对囊胚进行评分。

七、胚胎移植

（一）胚胎移植时机

根据患者子宫内膜，激素水平以及胚胎数量、质量等情况，可选择第3天的卵裂胚或第5天的囊胚进行移植。从时间和形态上，取卵日为第0天，卵裂期胚胎为取卵后第2~3天的胚胎，第2天的胚胎一般在4个细胞左右，第3天胚胎一般在8个细胞左右。囊胚是取卵后第5~6天的胚胎，囊胚的细胞数较多，一般在数十个甚至100个以上（图3-4-2）。

1.第3天卵裂胚移植

第3天的胚胎体外培养的时间短，可以获得较多的优质胚胎，但对胚胎的选择程度有限，胚胎的形态学不一定反映胚胎的活力。在正常自然妊娠时，第3天的胚胎仍位于输卵管腔，只有发育到囊胚阶段的胚胎才进入子宫腔开始着床。此时移植的胚胎与正常生理情况下相比，过早地进入子宫腔，与子宫内膜的发育不同步，胚胎着床之前在宫腔里悬浮一段时间，一般2天后才开始着床，因而胚胎停止发育甚至发生宫外孕的可能性相对较大。选择2个胚胎进行移植可以在一定程度上提高临床妊娠率，但这也增加了多胎妊娠的风险。

2.第5天囊胚移植

胚胎发育至第5天时，胚胎变成囊胚，主要优点是具有染色体异常的大多数胚胎不能进入第5天，能够发育到第5天的胚胎在形态学评分要比第3天更准确，可以更精确地选择具有最佳植入潜力的胚胎。同时，囊胚移植与子宫内膜容受窗同步，植入当日即开始着床，可以提高胚胎移植的成功率。由于提高了着床率，使得单囊胚移植成为可能，因此可避免移植多个胚胎造成多胎妊娠的风险。但缺点是由于延长体外培养的时间，存活下来的胚胎有可能减少，特别是当卵子数量较少，胚胎数量较少的情况下，有可能无胚胎可用，从而导致胚胎移植取消率升高。

（二）胚胎移植方式

根据移植的胚胎是新鲜的还是冷冻的可分为新鲜胚胎移植或者冻融胚胎移植（frozen thawed embyo，FET）。前者是在取卵、体外受精、胚胎培养后，将胚胎直接移植到子宫腔内。后者则在胚胎培养后，使用胚胎冷冻技术，将胚胎冷冻保存。在取卵周期后的某个月经周期内的特定时间点，将胚胎解冻复苏，然后移植入子宫腔的过程。胚胎冷冻的适应证主要有：①保存IVF周期中多余优质胚胎；②有重度OHSS倾向者，为避免其进一步加重，可将胚胎冷冻，留待以后移植；③胚胎移植时插管入宫腔非常困难者；④胚胎植入前遗传学诊断（PGD）后等待诊断结果；⑤IVF周期中移植时患者有感染发热、严重腹泻等内科并发症；⑥肿瘤患者在治疗病情控制后保存生育功能；⑦保存患者年轻时胚胎，供年纪大时移植（时控生育）。

（三）内膜准备方式

1.新鲜胚胎移植无需准备。

2.冻融胚胎移植

（1）自然周期：

适用于月经周期规律且排卵正常者。于月经第10天进行超声检测卵泡及内膜，当卵泡直径>14mm时，注意监测血清LH、E₂、P水平，当子宫内膜≥8mm，于排卵后根据冷冻胚胎龄选择相应的胚胎行FET。

（2）激素替代周期：

适用于各种原因导致的无自然排卵，如多囊卵巢综合征、卵巢功能衰竭等情况。可使用雌激素递增或恒量方案。月经来潮或药物撤退性出血第3天，超声监测盆腔情况，若子宫卵巢无异常，开始口服雌激素戊酸雌二醇3mg，每天2次，1周后超声监测内膜厚度。如内膜超过8mm，继续雌激素使用，持续时间≥12天；超声检查若内膜厚度<7mm，E₂低于150pg/ml，加用雌二醇片（芬吗通白片）0.5~1.0mg/d塞阴道5~7天，酌情加用阿司匹林、西地那非等。当内膜够厚（至少≥8mm）或雌激素水平已超过300pg/ml但内膜已无法增厚时，给予黄体酮（口服、阴道塞、肌内注射形式均可），按首次注射日算取卵日计算，选择符合胚胎龄的日期移植。

（3）促排卵周期：

适用于外源性雌激素不敏感，替代和自然周期内膜不理想，或前两种方案均未获妊娠。月经第3天开始给予他莫昔芬、来曲唑或hMG促排，超声监测卵巢及内膜情况，监测方法同自然周期。

（四）移植胚胎数

1.常规移植胚胎数≤2个，35岁以上可移植≤3个。

2.以下情况选择单胚胎移植　身高低于155cm；体重≤40kg或≥90kg；有子宫手术史，如瘢痕子宫（剖宫产后瘢痕子宫推荐移1个）、严重宫腔粘连分离术后、子宫畸形（单角子宫、双角子宫、T形子宫、双子宫等）、子宫畸形矫正手术、宫颈机能不全行孕前环扎术后、宫颈成形术后、宫颈部分切除术后；既往有宫颈机能不全导致的晚期流产或早产史；既往有产科并发症（如妊娠高血压综合征）或合并症（如糖尿病等）；PGD或植入前遗传学筛查（PGS）等。

3.以下情况推荐单胚胎移植　35岁以下；拥有≥2枚优胚；首次IVF或既往IVF有妊娠史。

4.以下情况建议全胚冷冻　有发生重度OHSS可能者：扳机日E₂>3 000pg/ml，实际获卵数超过15个或预计取卵数大于20个；胚胎移植日，患者出现腹胀，腹水或血细胞比容>45%。采用不适合新鲜周期移植的促排卵方案（如应用CC的方案、高孕激素促排方案等）。采用GnRH-a单扳机。有不良子宫内膜因素：取卵日子宫内膜回声欠均匀或宫腔积液；移植日发现子宫内膜过薄或子宫内膜回声不均。HCG注射日P≥1.5ng/ml或COH过程中2次及以上P>1.5ng/ml。COH过程Gn使用时间≥12天或≤6天。取卵日穿刺针穿过子宫体、靠近或经过内膜。取卵日出现需住院治疗的膀胱及其他穿刺损伤；白带异常；患者出现发热、感冒、腹泻等其他原因所致的身体不适。有输卵管积水，拟先行输卵管手术再移植。新鲜周期移植困难者取消移植。既往有IVF治疗失败史，拟改善内膜容受性后移植。患有不宜处于高雌激素状态的疾病。本次治疗有优质胚胎但数量少，要求积累胚胎。患者要求冻胚移植。移植日患病或不能来医院等特殊原因。

（五）胚胎移植前准备

1.由手术室护士及胚胎实验室人员核对患者身份，向夫妇双方详细解释胚胎移植的全过程，避免紧张情绪。向患者交代胚胎移植的时间并嘱充盈膀胱。

2.根据宫探结果进行胚胎移植操作，宫探显示困难者应在超声引导下移植，必要时憋尿。

（六）胚胎移植操作

1.阴道准备　患者取膀胱截石位，术者戴无菌手套，生理盐水擦洗外阴后铺无菌巾，阴道扩张器充分暴露宫颈，生理盐水擦去阴道及宫颈分泌物，小棉签蘸少许胚胎培养液轻轻擦去宫颈口黏液。如宫颈分泌物黏稠，在宫颈内形成黏液栓，应用棉签清除擦净。

2.困难宫探患者需助手腹部超声扫描，纵切显示子宫位置、宫腔形态及子宫内膜（宫探顺利者可略去此步）。

3.插外套管　胚胎移植管拆封后，一般分为内管和外管。外管可在内管或硬芯引导下通过宫颈内口。注意拿套管时，术者不可碰触导管前端。外套管插入宫颈内口后，迅速通知实验室用移植内管吸胚胎。

4.移植　由实验室人员再次核对患者身份无误，将吸有胚胎的移植内管顺着移植外管插入宫腔，将内管前端插入到距宫底1.0~1.5cm处，静止片刻（15~30秒），缓慢推注注射器活塞将胚胎注入宫腔，保持推注力缓慢撤管（图3-4-3）。

5.取出移植内外管，送实验室检查有无胚胎残留，如有胚胎残留可再次移植。

6.临床医生和实验室人员按照胚胎移植记录单的内容逐项填写移植过程。

（七）胚胎移植后处理

1.移植后患者静卧0.5小时，无不适后即可离院。嘱患者移植后避免剧烈运动，但不必完全卧床休息，注意预防感冒。嘱患者若有腹胀、恶心、呕吐、体重明显增加等卵巢过度刺激综合征症状，立即回院。

2.其他注意事项　移植有疼痛或宫缩者，可注射间苯三酚或阿托西班；移植特别困难者，应将胚胎冷冻保存，进一步行宫探，查明确原因；移植后10~12天抽血验HCG。

3.黄体支持　新鲜胚胎移植患者取卵后即开始黄体支持，最晚不超过移植日。移植后10~12天如HCG检查显示妊娠，继续应用黄体支持至ET后5周左右行早孕期超声检查，确定宫内妊娠后可考虑逐步减量，至妊娠10~12周停止黄体支持。

八、卵胞质内单精子注射

卵胞质内单精子注射（ICSI），也称第二代试管婴儿技术，是在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）基础上发展起来的显微受精技术，通过直接将精子注射入卵母细胞胞质内，来达到助孕目的，主要解决精液因素导致的男性不育。

（一）适应证

1.严重的少精子症、弱精子症、畸形精子症　如重度少精子症（精液中精子浓度<5×106/ml）；重度弱精子症（精子前向运动百分率<10%）；极重度畸形精子症（精液中正常形态精子百分率<1%）；或者精液优化后精子前向运动总数<5×106。

2.阻塞性无精子症或非阻塞性无精子症　通过附睾或睾丸手术获得数目很少或活动力很差的精子。

3.取卵后不能射精又无备用精子，并拒绝冻卵，不得已可在征求患者和家属意见的情况下，采用附睾或睾丸精子进行ICSI，作为一种补救措施。

4.前次IVF受精异常　前次IVF不受精、低受精或高比例的多精受精，前次低受精（受精率<30%）。

5.卵子存在特殊情况　如冷冻保存卵和未成熟而经体外培养的卵子授精。成熟卵子经冷冻保存后，或不成熟卵子经体外培养成熟后，透明带变硬，精子不易穿透。建议行ICSI辅助授精。

6.其他经冻存的精子可能会有损伤，有时需经ICSI辅助授精。拟进行PGT的胚胎需ICSI受精。

（二）基于ICSI的IVF-ET技术操作流程

和常规IVF-ET技术类似，基于ICSI的IVF-ET技术操作流程同样包括控制性超促排卵、取卵、精液获取、体外受精-胚胎移植环节，区别在于精子获取的方式和体外受精的方式。ICSI的精子获取常借助经皮附睾穿刺取精术（PESA）、经皮睾丸穿刺取精术（TESA）、显微镜下睾丸取精术（MTSA）、睾丸切开取精术（TESE）等技术，而体外受精的方式是借助卵胞质内单精子注射技术辅助精子和卵子受精（图3-4-4）。

（三）ICSI技术过程

1.取卵后38小时，将COCs移入透明质酸酶中快速吹打，去除大多数颗粒细胞后，用合适的剥卵针去除剩余的颗粒细胞，平衡30分钟以上。

2.在显微注射装置上安装持卵针和显微注射针，使两者处于同一水平。

3.在精子制动液中加入精子，置于显微镜下，下降显微注射针，轻柔地划伤精子尾部2/3处，进行制动。

4.从精子尾部将精子吸入显微注射针，将视野移入显微注射微滴，调整显微注射针和持卵针至同一水平后，用持卵针固定卵子，使其极体位于6点或12点方向，推动注射针，将精子注入卵子，撤针。

九、胚胎植入前遗传学检测

胚胎植入前遗传学检测（PGT），也称第三代试管婴儿技术，指在IVF-ET的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，筛选健康胚胎进行移植的方法，包括胚胎植入前非整倍体检测（PGT-A）和胚胎植入前单基因遗传学检测（PGT-M）等。

（一）适应证

1.胚胎植入前非整倍体检测（PGT-A）

（1）夫妇双方或一方存在染色体疾病，如染色体平衡易位、罗伯逊易位、倒位、性染色体数目异常、染色体微缺失等，需要选择染色体平衡的胚胎移植。

（2）既往生育过染色体异常的孩子。

（3）既往流产或引产，胚胎经检测发现染色体异常。

（4）复发性流产。

（5）反复IVF治疗失败。

（6）女方高龄。

（7）严重畸形精子症。

2.胚胎植入前单基因遗传学检测（PGT-M）

由于家族存在遗传性单基因病需行植入前诊断，如血友病、地中海贫血等。

（二）实验室操作

1.准备活检皿（卵裂球活检使用无Ca2+、Mg2+的活检液）。

2.在显微注射装置上安装持卵针和活检针，使两者处于同一水平。

3.将卵子、卵裂期胚胎或者囊胚置于活检微滴中，进行下一步相应的极体、卵裂球或者滋养层细胞活检；活检囊胚建议在培养至第4天用激光辅助孵化仪进行透明带单点打孔。

4.活检

（1）极体或卵裂球活检：确定活检位置，驱动持卵针在目标对侧固定卵子或胚胎；用激光辅助孵化仪在邻近活检目标的透明带单点打孔，将活检针通过该孔移动至活检目标处，使用负压轻轻吸取活检材料后，撤出活检针，将材料从活检针中吹入活检液。

（2）滋养层细胞活检：确定活检位置，驱动持卵针在目标对侧固定囊胚；对于滋养层细胞已孵出者，用活检针吸住待检细胞后，用激光辅助孵化仪的活检模式切割滋养细胞，切割细胞数在5~8个，活检获得的材料从活检针中吹入活检液。若囊胚已扩张但未孵出，用激光辅助孵化仪在邻近活检目标的透明带单点打孔，将活检针通过该孔移动至活检目标处，轻轻吸取滋养细胞并逐步拖至透明带外，然后按已孵出囊胚的操作流程获取活检材料。

（徐维海　黄琼晓　舒　静）